Fluorescentna mikroskopija: načela metode

Apsorpcija i daljnja ponovna procjena svjetlosti anorganskim i organskim medijima rezultat je fosforescencije ili fluorescencije. Razlika između fenomena sastoji se od trajanja intervala između apsorpcije svjetla i emisije fluida. S fluorescencijom se ti procesi pojavljuju gotovo istodobno, a s fosforescencijom - s nekim zakašnjenjem.

Povijesna pozadina

Godine 1852. britanski znanstvenik Stokes najprije je opisao fluorescenciju. Uveo je novi izraz kao rezultat eksperimenata fluorit, koja je emitirala crveno svjetlo pod utjecajem ultraljubičastog zračenja. Stokes je zabilježio zanimljiv fenomen. Otkrio je da je valna duljina s fluorescentnim zračenjem uvijek veća od one u uzbudnom svjetlosnom toku.

Kako bi potvrdili hipotezu u 19. stoljeću, provedeni su mnogi eksperimenti. Pokazali su da se različiti uzorci fluoresciraju pod djelovanjem ultraljubičastog zračenja. Među materijalima, između ostalog, bio kristala, smole, minerala, klorofila, sirove droge, anorganski spojevi, vitamine, ulja. Izravna primjena boja za provedbu biološke analize počela je tek 1930.

Fluorescentna mikroskopija: opis

Neki od materijala korištenih u istraživanjima prve polovice 20. stoljeća imali su visoku specifičnost. Zahvaljujući pokazateljima koji se ne mogu postići kontrastnim metodama, fluorescentna mikroskopska metoda postalo je važan alat u biomedicinskim i biološkim istraživanjima. Dobiveni rezultati nisu bili značajni za znanost o materijalima.

Koje su prednosti fluorescentne mikroskopije?? Uz pomoć novih materijala postalo je moguće izolirati visoko specifične stanice i submikroskopne komponente. Fluorescentni mikroskop može detektirati pojedine molekule. Razne boje omogućavaju istodobno prepoznavanje nekoliko elemenata. Unatoč ograničenoj prostornoj razlučivosti opreme pomoću granice difrakcije, što zauzvrat ovisi o specifičnim svojstvima uzorka, otkrivanje molekula ispod te razine je također sasvim moguće. Različiti uzorci nakon ozračivanja pokazuju autofluorescenciju. Ovaj fenomen se široko koristi u petrology, botanici, poluvodičkoj industriji.

Značajke

Studija životinjskih tkiva ili patogene često komplicirane ili preslab ili vrlo jake nespecifični autofluorescencija. Međutim, značaj u studijama je uvođenje u materijal komponenata uzbudljivih na određenu valnu duljinu i emitiranje svjetlosnog toka potrebnog intenziteta. Fluorkromi djeluju kao boje koje se mogu pričvrstiti na strukture (nevidljive ili vidljive). Istovremeno, oni su vrlo selektivni s obzirom na ciljeve i kvantni prinos.

Fluorescentna mikroskopija postao je široko korišten s dolaskom prirodnih i sintetičkih boja. Imali su određene profile intenziteta emisije i uzbude i bili su usmjereni na specifične biološke ciljeve.

Identifikacija pojedinačnih molekula

Često, pod idealnim uvjetima, može se registrirati sjaj pojedinog elementa. Da biste to učinili, među ostalim, potrebno je osigurati dovoljno nisku razinu detektora i optičku pozadinu. Molekula fluoresceina prije uništenja zbog fotobležiranja može emitirati do 300 tisuća fotona. Na 20% prikupljanja i učinkovitosti procesa, oni se mogu registrirati u iznosu od oko 60 tisuća.

Fluorescentna mikroskopija, na temelju lavina fotodiodama ili elektroničkom množenja, omogućilo istraživačima da promatraju ponašanje pojedinih molekula kroz drugi, au nekim slučajevima čak minuta.

složenost

Ključni problem je suzbijanje buke iz optičke pozadine. Zbog činjenice da mnogi od materijala koji se koriste u dizajnu filtera i leća pokazuju autofluorescenciju, napori znanstvenika u početnim fazama bili su usredotočeni na proizvodnju komponenti s niskom fluorescencijom. Međutim, naknadni pokusi doveli su do novih zaključaka. Konkretno, utvrđeno je da fluorescentna mikroskopija, temelji se na punom unutarnjem refleksiju, omogućava postizanje niske pozadine i uzbudljivog svjetlosnog toka visokog intenziteta.

mehanizam

Načela fluorescencijske mikroskopije, na temelju ukupne unutarnje refleksije, sastoji se u korištenju brzo propadajućeg ili neprepojnog vala. Pojavljuje se na granici različitih medija refraktivni indeksi. U tom slučaju, svjetlosna zraka prolazi kroz prizmu. Ima visoki indeks loma.

Prizmom se pričvršćuje na vodenu otopinu ili staklo s niskim parametrom. Ako se struja svjetlosti usmjerava na nju pod kutom veću od kritičnog, zraka se potpuno reflektira iz sučelja. Taj fenomen, zauzvrat, uzrokuje val koji ne propagira. Drugim riječima, generira se elektromagnetsko polje koje prodire u medij s manjim indeksom refrakcije za udaljenost manju od 200 nanometara.

U ne-propagirajućem valu intenzitet svjetlosti bit će dovoljno da pobudi fluorofore. Međutim, zbog svoje iznimno male dubine, njegov će volumen biti vrlo mali. Kao rezultat toga, pojavljuje se pozadina niske razine.

modifikacija

Fluorescentne mikroskopije se temelji na potpuno unutarnje odbijanje, može se provoditi s epi-osvjetljenje. To zahtijeva leće s povećanim numeričkim otvorom (najmanje 1,4, ali je poželjno da dosegne 1,45-1,6), kao i djelomično osvijetljeno polje uređaja. Potonji se postiže pomoću mjesta male veličine. Za veću jednolikost upotrebljava se tanki prsten, kroz koji je blokiran dio toka. Za postizanje kritičnog kuta, nakon čega dolazi do potpunog refleksija, potrebno je visoku razinu refrakcije medija za uranjanje u leće i pokrovno staklo mikroskopa.