Molekularno-biološke metode istraživanja i njihova upotreba

molekularna biologija metode istraživanja

Molekularne biološke metode ispitivanja. Što je to?

Natrag u 70-ima i 80-ima, znanstvenici su prvi put mogli dešifrirati ljudski genom. Ovaj je događaj potaknuo razvoj genetskog inženjerstva i molekularne biologije. Istraživanje svojstava DNA i RNA dovelo je do činjenice da je sada moguće koristiti ove nukleinske kiseline radi dijagnosticiranja bolesti, za proučavanje gena.

Priprema DNA i RNA

molekularna biologija dijagnostičke metode zahtijevaju prisutnost početnog materijala: češće su nukleinske kiseline. Postoji nekoliko načina izoliranja tih tvari iz stanica živih organizama. Svaka od njih ima svoje prednosti i nedostatke, a to se mora uzeti u obzir prilikom odabira metode izolacije nukleinskih kiselina u čistom obliku.

1. Priprava DNA prema Marmuru. Postupak se sastoji u obradi mješavine tvari s alkoholom, čime se čisti DNA precipitira. Nedostatak ove metode je uporaba agresivnih tvari: fenola i kloroforma.

2. Izolacija DNA Boom-om. Osnovna tvar upotrijebljena ovdje je guanidin tiocijanat (GuSCN). Potiče padaline deoksiribonukleinska kiselina na specijaliziranim podlogama, od kojih se u budućnosti može prikupiti pomoću posebnog spremnika. Međutim GuSCN - inhibitor TCP, pa čak i mali dio koji se taloži u DNA može utjecati na tijek reakcije polimeraze lanca, što je važno kada se radi s nukleinskim kiselinama.

3. taloženje nečistoća. Metoda se razlikuje od prethodnih jer se same molekule same deoksiribonukleinske kiseline ne talože, već nečistoće. Da biste to učinili, koristite ionske izmjenjivače. Nedostatak je da se ne mogu precipitirati sve tvari.

4. Masovni screening. Ova se metoda koristi u onim slučajevima kada nije potrebna precizna informacija o sastavu DNA molekule, ali je potrebno dobiti neke statističke podatke. To je zbog činjenice da se struktura nukleinske kiseline može oštetiti tretmanom deterdžentima, posebice alkalijama.

Razvrstavanje metoda istraživanja

Sve molekularne biološke metode istraživanja su podijeljene u tri velike skupine:

1. Pojačanje (koristeći različite enzime). To uključuje lančanu reakciju PCR - polimeraze koja ima veliku ulogu u mnogim dijagnostičkim metodama.

2. ne-apelacija. Ova grupa metoda izravno je povezana s djelovanjem mješavina nukleinskih kiselina. Primjeri su 3 vrste blotanja, in situ hibridizacija itd.

3. Metode temeljene na prepoznavanju signala molekule sonde koja se veže na specifičnu DNA ili RNA sondu. Primjer je hibridizacijski sustav u sustavu hibridnog sustava hvatanja (hc2).

Enzimi koji se mogu koristiti u molekularnim biološkim metodama

Mnoge metode molekularne dijagnostike uključuju upotrebu širokog raspona enzima. Ispod su najčešće korišteni:

1. Ograničiti - "presijeca" DNA molekulu u potrebne dijelove.

2. DNA polimeraza - sintetizira dvolančanu molekulu deoksiribonukleinske kiseline.

3. Reverse transkriptaza (revertaza) - korištena za sintezu DNA na RNA matrici.

4. DNA ligaza - odgovorna za formiranje fosfodiesternih veza između nukleotida.

5. Eksonukleaza - uklanja nukleotide iz krajnjih sekcija molekule deoksiribonukleinske kiseline.

PCR je glavni način za pojačavanje DNA

Lančana reakcija polimeraze (PCR) aktivno se koristi u suvremenoj molekularnoj biologiji. Ovo je metoda u kojoj se može dobiti ogroman broj kopija iz jedne molekule DNA (amplificiraju molekule).

Glavne funkcije PCR-a su:

- dijagnostika bolesti;

- kloniranje DNA, gena.

Provesti lančane reakcije polimeraze zahtijeva sljedeće elemente: početni DNA molekula, termostabilna DNK polimeraza (Taq ili Pfu) deoksiribonukleotidna fosfate (izvori dušikovih baza), a primera (prajmer 2 1 molekula DNA) sam puferski sustav, u kojem su sve reakcije moguće.

PCR se sastoji od tri faze: denaturacija, žarenja osnovica i produženja.

1. Denaturacija. Na temperaturi od 94-95 stupnjeva Celzija, nastavlja se lom vodikovih veza između dva niza DNK i kao rezultat dobivamo dvije molekule s jednim lancem.

2. Ispiranje klica. Na temperaturi od 50-60 stupnjeva Celzija, primeri su pričvršćeni na krajevima jednolančanih molekula nukleinske kiseline prema vrsti komplementarnosti.

3. Istezanje. Na temperaturi od 72 stupnja dolazi do sinteze dvostrukih lanaca molekula deoksiribonukleinske kiseline.

Sekvencioniranje DNA

Molekularne biološke metode često zahtijevaju poznavanje slijeda nukleotida u molekuli deoksiribonukleinske kiseline. Utvrditi genetskog koda provodi sekvenciranje. Molekularna dijagnostika budućnosti temeljit će se na znanju dobivenom pri određivanju slijeda osobe.

Razlikuju se sljedeće vrste sekvencioniranja:

• sekvencioniranje Maxam-Gilberta;
• sekvenciranje Sanger;
• pyrosequencing;
• nanoporozno sekvenciranje.