Imobilizirani enzimi i njihova upotreba

Prvi put koncept imobiliziranih enzima nastao je u drugoj polovici 20. stoljeća. U međuvremenu, već 1916. godine, otkriveno je da saharoza sorba na ugljenu zadržava svoju katalitičku aktivnost. Godine 1953. D. Schleit i N. Grubhofer izvode prva vezanja pepsina, amilaze, karboksipeptidaze i RNaze s netopivim nosačem. Koncept imobiliziranih enzima legaliziran je 1971. godine. To se dogodilo na prvoj konferenciji o inženjerskoj enzimologiji. U ovom trenutku koncept imobiliziranih enzima

Opće informacije

iimobilizirani enzimi spojevi koji su umjetno vezani za netopljivi nosač. Istovremeno, oni zadržavaju svoje katalitičke osobine. Trenutno, ovaj proces je uzeti u obzir dva aspekta - u granicama djelomične i potpune slobode kretanja molekula proteina.

dostojanstvo

Znanstvenici su se utvrdili prednosti imobiliziranih enzima. Djelujući kao heterogeni katalizatori mogu se jednostavno odvojiti od reakcijskog medija. Kao dio istraživanja, utvrđeno je da primjena imobiliziranih enzima može biti višestruko. Tijekom procesa vezanja, spojevi mijenjaju svojstva. Oni stječu specifičnost supstrata, stabilnost. Istodobno, njihova aktivnost počinje ovisiti o uvjetima okoline. Imobilizirani enzimi razlikuju se po svojoj trajnosti i visokom stupnju stabilnosti. To je više od, na primjer, slobodnih enzima u tisućama, desetcima tisuća puta. Sve to osigurava visoku učinkovitost, konkurentnost i ekonomiju tehnologija u kojima su imobilizirani enzimi prisutni.

nositelji

J. Poratu definirao je ključna svojstva idealnih materijala koji bi se trebali koristiti za imobilizaciju. Mediji moraju imati:

1. Neotopljivost.
2. Visoka biološka i kemijska otpornost.
3. Sposobnost za brzo aktiviranje. Nositelji bi se trebali lako transformirati u reaktivnu vrstu.
4. Značajna hidrofilnost.
5. Potrebna propusnost. Njegov indeks bi trebao biti jednako prihvatljiv za enzime, i za koenzime, reakcijske proizvode i supstrate.

Trenutačno nema materijala koji u potpunosti udovoljava tim zahtjevima. Ipak, u praksi se koriste nosači koji su pogodni za imobilizaciju određene kategorije enzima pod određenim uvjetima.

klasifikacija

Ovisno o njihovoj prirodi, materijali u kojima se spojevi pretvaraju imobilizirani enzimi, podijeljeni su u anorganske i organske. Vezanje mnogih spojeva provodi se s polimernim nosačima. Ovi organski materijali podijeljeni su u dvije klase: sintetički i prirodni. U svakom od njih, zauzvrat, skupine se razlikuju ovisno o strukturi. Anorganski nosači uglavnom se sastoje od stakla, keramike, glina, silikagela, grafitne crne boje. Kada radite s materijalima, metode suhe kemije su popularne. Imobilizirani enzimi dobiveni su premazivanjem nosača s filmom titan oksidi, aluminij, cirkonij, hafnium ili prerada s organskim polimerima. Važna prednost materijala je jednostavnost regeneracije.

Proteinski nosači

Najpopularniji su lipidi, polisaharidi i proteinski materijali. Među ostalim, vrijedi naglasiti strukturne polimere. Primarno uključuju kolagen, fibrin, keratin, kao i želatinu. Takvi proteini su široko rasprostranjeni u prirodnom okolišu. Oni su pristupačni i ekonomični. Osim toga, oni imaju veliki broj funkcionalnih skupina za vezivanje. Proteini se razlikuju po sposobnosti biorazgradnje. To omogućuje proširenje aplikacije imobilizirani enzimi u medicini. U međuvremenu, tu su i negativna svojstva proteina. Nedostaci korištenja imobiliziranih enzima na nosiocima proteina su visoka imunogenost potonjeg, kao i mogućnost uvođenja u reakciju samo određene skupine.

Polisaharidi, aminosaharidi

Od tih materijala najčešće se koriste hititin, dekstran, celuloza, agaroza i njihovi derivati. Da bi polisaharidi bili otporniji na reakcije, njihovi linearni lanci su umreženi s epiklorohidrinom. Različite ionogene skupine slobodno se uvode u strukture mreže. Chitin se nakuplja u velikim količinama u obliku otpada tijekom industrijske prerade škampi i rakova. Ova tvar je kemijski otporna i ima dobro definiranu poroznu strukturu.

Sintetički polimeri

Ova grupa materijala je vrlo raznovrsna i dostupna. To uključuje polimere na bazi akrilne kiseline, stirena, polivinil alkohol, poliuretanski i poliamidni polimeri. Većina ih se razlikuje mehanički. Tijekom pretvorbe oni pružaju mogućnost različitih veličina pora u širokom rasponu, uvođenje različitih funkcionalnih skupina.

Načini vezivanja

Trenutačno postoje dvije temeljno različite verzije imobilizacije. Prva je priprava spojeva bez kovalentnih veza s nosačem. Ova je metoda fizička. Druga mogućnost uključuje stvaranje kovalentne veze s materijalom. Ovo je kemijska metoda.

adsorpcija

S njom imobilizirani enzimi dobiven zadržavanje lijeka na površini nosača zbog hidrofobnih, disperzije, elektrostatskim interakcijama i vodikove veze. Adsorpcija je bio prvi način ograničavanja mobilnosti elemenata. Međutim, čak i sada ova opcija nije izgubila relevantnost. Štoviše, adsorpcija se smatra najčešćim načinom imobilizacije u industriji.

Značajke metode

U znanstvenim publikacijama opisano je više od 70 enzima, dobivenih adsorpcijskom metodom. Nositelji su uglavnom porozno staklo, razni gline, polisaharidi, aluminijski oksidi, sintetički polimeri, titani i drugi metali. Potonji se najčešće koriste. Učinkovitost adsorpcije lijeka na nosaču određena je poroznošću materijala i specifičnom površinom.

Mehanizam djelovanja

Adsorpcija enzima na netopivim materijalima je jednostavna. To se postiže kontaktiranjem vodene otopine lijeka s nosačem. Može se odvijati na statički ili dinamički način. Enzimska otopina pomiješa se sa svježim talogom, na primjer titanovim hidroksidom. Zatim, u blagim uvjetima, spoj se osuši. Enzimska aktivnost s ovom imobilizacijom gotovo je 100%. Istovremeno, specifična koncentracija doseže 64 mg po gramu nosača.

Negativni trenuci

Nedostaci adsorpcije uključuju nisku čvrstoću prilikom vezanja enzima i nosača. U procesu promjena uvjeta reakcije može se primijetiti gubitak elemenata, kontaminacija proizvoda, desorpcija proteina. Kako bi se povećala čvrstoća vezanja, nositelji su prethodno modificirani. Konkretno, materijali se obrađuju metalnim ionima, polimerima, hidrofobnim spojevima i drugim polifunkcionalnim sredstvima. U nekim slučajevima, modifikacija se podvrgava samom lijeku. No, često to dovodi do smanjenja aktivnosti.

Ugrađivanje u gel

Ova opcija je vrlo česta zbog svoje jedinstvenosti i jednostavnosti. Ova metoda je prikladna ne samo za pojedinačne elemente već i za komplekse multienzima. Uključivanje u gel može se provesti na dva načina. U prvom slučaju, pripravak se kombinira s vodenom otopinom monomera, nakon čega slijedi polimerizacija. Kao rezultat toga, pojavljuje se prostorna struktura gela, koja sadrži molekule enzima u stanicama. U drugom slučaju, pripravak se dodaje otopini gotovog polimera. Zatim se prenosi u stanje gela.

Ugrađivanje u poluprozirne strukture

Bit ove metode imobilizacije je odvajanje vodene otopine enzima od supstrata. Za to se koristi polupropusna membrana. Prolazi male molekularne elemente kofaktora i supstrata i odgađa velike molekule enzima.

mikrokapsuliranja

Postoji nekoliko mogućnosti za uvođenje u poluprozirne strukture. Od najvećeg interesa su mikrokapsuliranje i ugradnja proteina u liposome. Prvu varijantu predložio je 1964. T. Chang. Sastoji se od činjenice da se enzimska otopina uvodi u zatvorenu kapsulu čiji su zidovi izrađeni od polupropusnog polimera. Pojava membrane na površini uzrokovana je reakcijom polumondenziranja međufaznih spojeva. Jedan od njih je otopljen u organskom, a drugi - u vodenoj fazi. Kao primjer može se spomenuti tvorbu mikrokapsula dobiven polikondenzacijom sebainska halida kiseline na sebi (-Organska faza) i 1,6-heksametilendiamin (odnosno, vodena faza). Debljina membrane izračunata je u stotinama mikrometra. U ovom slučaju veličina kapsula je stotina ili desetaka mikrometara.

Ugradnja u liposome

Ova metoda imobilizacije je blizu mikrokapsuliranja. Liposomi su zastupljeni u lamelarnim ili sferičnim sustavima lipidnih dvosloja. Ova je metoda prvi put korištena 1970. godine. Isparavanje organskog otapala se provodi kako bi se izolirali liposomi iz lipidne otopine. Preostali tanki sloj se dispergira u vodenoj otopini u kojoj je prisutan enzim. Tijekom tog procesa odvija se samonastavljanje lipidnih dvoslojnih struktura. Vrlo su popularni takvi imobilizirani enzimi u medicini. To je zbog činjenice da je većina molekula lokalizirana u lipidnoj matrici bioloških membrana. Uključeno u liposome imobilizirani enzimi u medicini su najvažniji istraživački materijal koji omogućuje proučavanje i opisivanje zakona životnih procesa.

Stvaranje novih veza

Imobilizacija formiranjem novih kovalentnih lanaca između enzima i nosača smatra se najmasovnom metodom dobivanja industrijskih biokatalizatora. Za razliku od fizičkih metoda, ova opcija pruža nepovratnu i snažnu vezu između molekule i materijala. Njeno obrazovanje često prati stabilizacija droga. Istovremeno, mjesto enzima na udaljenosti od prve kovalentne veze u odnosu na nosač stvara određene poteškoće u provođenju katalitičkog procesa. Molekula se odvaja od materijala pomoću umetka. Poli i bifunkcionalni agensi često djeluju kao oni. Su, posebno, hidrazin, cijanogen bromid, glutaraldehid dialgedrid, sulfuril klorid, itd. Na primjer, za izvođenje galactosyltransferase enzim iz medija, a slijedeća sekvenca umetnuta -CH₂-NH- (CH₂)₅-CO-. U takvoj situaciji postoji struktura umetka, molekule i nosača. Svi su povezani kovalentnim vezama. Od temeljne važnosti je potreba za uvođenjem u reakcijske funkcionalne skupine koje nisu neophodne za katalitičku funkciju elementa. Dakle, u pravilu, glikoproteini su vezani na nosač ne kroz protein, već kroz dio ugljikohidrata. Kao rezultat, stabilniji i aktivniji imobilizirani enzimi.

stanice

Gore opisane metode smatraju univerzalnim za sve vrste biokatalizatora. Među njima, među ostalima, uključuju stanice, subcelularne strukture, imobilizacija koja je nedavno postala široko rasprostranjena. To je zbog sljedeće. Kada imobiliziraju stanice, nema potrebe za izoliranjem i pročišćavanjem enzimskih pripravaka, kako bi se uvodili kofaktori u reakciju. Kao rezultat, postaje moguće postići sustave koji obavljaju višestupanjske, kontinuirane procese.

Upotreba imobiliziranih enzima

U veterinarskoj medicini, industrija, drugi gospodarski sektori su vrlo popularni pripravci dobiveni gore navedenim metodama. Pristupi razvijeni u praksi daju rješenje problema u provedbi ciljanog davanja lijeka u tijelu. Imobilizirani enzimi omogućili su dugotrajno djelovanje lijekova s ​​minimalnom alergenom i toksičnošću. Trenutno znanstvenici rješavaju probleme vezane uz biokonverziju mase i energije pomoću mikrobioloških pristupa. U međuvremenu, tehnologija imobiliziranih enzima također čini značajan doprinos radu. Izgledi za razvoj su dovoljno široki za znanstvenike. Dakle, u budućnosti, jedna od ključnih uloga u procesu kontrole nad stanje okoliša trebala bi pripadati novim vrstama analiza. Posebno govorimo o bioluminiscentnom i imunoenzimske metode. Od posebne su važnosti napredni pristupi u preradi lignoceluloznih sirovina. Moguće je koristiti imobilizirane enzime kao pojačala slabih signala. Aktivni centar može biti pod utjecajem nosača pod ultrazvukom, mehaničkim stresom ili osjetljivim na fitokemijske transformacije.